Objectif : trouver la séquence d'un plasmide, trouver les séquences de restriction et déterminer les sites et fragments de restriction (digestion virtuelle)
Ce scénario est un complément aux TP de BioUtils :
Expérience 2: Analyse de plasmides à l'aide d'enzymes de restriction. Il faut calbrer les doses et par exemple il a fallu augmenter la dose (6x) pour le plasmide pUC19 avec BamHI.
Dans cette expérience, le plasmide pUC19 est digéré à l'aide des enzymes de restriction Sau3A et BamHI
Définition d'un enzyme de restriction: Wikipedia
1) Trouver des infos et la séquence en acides nucléiques du plasmide pUC19
Les infos : La meilleure façon de trouver des informations sur les plasmides est d'utiliser les catalogues des biotech qui vendent les produits de laboratoires aux biologistes.
Le catalogue New England Biolabs est une mine d'information
Aller chercher l'information sous "Nucleic acid, cloning vectors" solution
Fiche d'info sur le plasmide puc19: On trouve entre autre comme information que la séquence est disponible dans la banque de données EMBL(=GenBank) avec le numéro d'accession (AC) L09137
Remarque : Pour le Plasmide pUC19-TIF1 utilisé par Linder : il s'agit du plasmide pUC19 dans lequel un gène de la levure (tif1) à été cloné dans un site BamH1; on ne peut donc pas retrouver sa séquence sur le web. Nous vous la proposons séquence pUC19-TIF1
La séquence en acide nucléique du plasmide : Aller chercher dans EMBL/Genbank la séquence du plasmide pUC19;
Aller sur le site du NCBI et faites "Search Nucleotide L09137"
Récupérer la séquence du plasmide en format Fasta: cliquer sur "Display Fasta" solution
2 Digestion "in silico" de la séquence du plasmide pUC19 avec Sau3A et BamHI
Différentes approches sont possibles
Approche no 2a: Rechercher la séquence reconnue par l'enzyme de restriction manuellement
- Chercher la séquence (site de coupure, site de reconnaissance) reconnue par l'enzyme de restriction:
- pour cela on doit faire appel à des banques de données spécialisées dans les enzymes de restriction comme par exemple Rebase
- Chercher des information sur Sau3A (aussi appelé Sau3aI) solution On trouve que cet enzyme coupe 5' ^GATC 3'
- Chercher des information sur le site de reconnaissance de BamHI Attention, BamHi et non pas Bamh1 ! solution On trouve que cet enzyme coupe sur le site 5' G^GATCC 3'
- Rechercher le site de reconnaissance dans la séquence du plasmide pUC19
- Copier /coller la séquence du plasmide en format fasta dans un éditeur de texte, et supprimer les retours de lignes (par exemple avec word)
- Recherche les motifs GATC et GGATCC dans le "texte" de la séquence du plasmide à l'aide de Ctrl/pomme F
- Souvent cette approche pose un problème si le site de reconnaissance est à cheval sur 2 lignes du texte
- Supprimer les nombres et les espaces et les fin de lignes pour faire une longue séquence sans interruption.
Solution : 
Le site de restriction de BamHI dans puc19 mis en évidence
- Pour obtenir les fragments séparément :
- Rechercher - remplacer la séquence de restriction par sticky -un return -sticky Solution.
- (les bouts collants =sticky)
- Exemple de pUC19 digéré avec un autre enzyme: Hpa II : Solution.
- Corréler les bandes dans le gel (exemple) et le nombre de lignes de texte ( Numéros dans le gel
1 : pUC19 HpaII 2 : pUC19 BamHI 3 : pUC19-TIF1 HpaII 4 : pUC19-TIF1 BamHI (1) 5 : pUC19 Aucun enzyme de restriction 6 :Poids moléculaire
Option didactique possible: imprimer le texte, découper les fragments et simuler un gel d'électrophorèse au tableau.
Approche no 2b: Utiliser un outil bioinformatique "fait pour" rechercher des sites de restriction dans une séquence en acides nucléiques
-> Digérer les plasmides
in silico avec les enzymes de restriction Sau3A et BamHI
Il existe plusieurs sites qui proposent en fait souvent le même programme appelé NEBcutter2
Exemple 2b: Biolabs
- NEBcutter2
- Options du programme
- - Sélectionner le nom du plasmide dans la liste
- - La séquence est circulaire (il s'agit d'un plasmide !)
- - Sélection les enzymes NEB (New England Biolabs)
- Soumettre (Submit)
- Le programme définit tous les sites de restriction avec tous les enzymes en présente certains sur la carte -> retourne une image : il y a trop de sites de restriction pour qu'ils soient tous illustrés
- Afin de pouvoir sélectionner les enzymes de votre choix, cliquer sur "Custom digest" et sélectionner les enzymes Sau3A et BamHI solution
- Ensuite cliquer sur "Digest" (touche verte en bas de la page)exemple
- Dans les options principales (main options) de la page des résultats, vous avez la possibilité de voir un gel virtuel (exemple)
- Cliquer View Gel , puis choisir Gel Type 1.4% agarose, et le marqueur Lambda BSTE EII Digest (image )
- On obtient 3 séries de bandes : 1) le marqueur de taille - 2) ADN non-méthylé 3)ADN méthylé
- Marqueurs de taille :
| Dernière révision novembre 2009. Au rythme où les choses changent, il faut s'attendre à ce que certains liens ne fonctionnent plus ou que l'apparence voire la structure de certains sites aitent changé d'apparence. Le lecteur saura adapter |
Liens :
- Sur le site In-Silico-com, vous pouvez choisir un génome bactérien et le digérer avec l'enzyme de votre choix
- Autre site web watcut permettant de visualiser de façon conviviale les sites de coupures sur une séquence
- Simulation in-silico d'expériences de labo
- Essai en classe de ce scénario intégré partiellement dans celui de Linder n° 2
- Sélection de liens BIST
