TRAVAIL DE MATURITE Collège Calvin septembre 2002

La phénylcétonurie

LA PHENYLCETONURIE ET SES TRAITEMENTS ACTUELS OU AVENIR.

Natahlie Tafer

I Introduction :

I Introduction :

Certaines maladies sont provoquées par des gènes défectueux qui produisent des protéines défectueuses. Les symptômes des maladies héréditaires sont souvent causés par le mauvais fonctionnement de protéines. Si un gène particulier est défectueux, il risque de ne pas fabriquer de produit protéique, ou d'en fabriquer un qui fonctionne mal. On appelle ces gènes défectueux oncongènes. Le rôle de la thérapie génique est, contrairement aux médicaments classiques, de parvenir à corriger, à l'intérieur de la cellule d'un organisme humain, les anomalies qui, en affectant son génome, sont responsables de pathologies graves et, le plus souvent, incurables. La thérapie génique est donc un mode de traitement d'un trouble génétique par lequel on insère de nouveaux gènes dans les cellules humaines. De nombreux essais de thérapie génique visent à ajouter dans un certain type de cellules, dites cibles, un gène qui essaye de remplacer la version manquante ou défectueuse d'un gène, il convient de noter que même les techniques de thérapie les plus avancées n'en sont encore qu'au stade des essais cliniques et que leur application générale n'a pas encore été approuvée. Selon les types de cellules affectées, on peut classer la thérapie génique en deux grandes catégories: la thérapie de la lignée germinale et la thérapie de la lignée somatique. La thérapie de la lignée germinale consiste à modifier les cellules reproductrices, ce qui signifie que les modifications génétiques seront transmises à la descendance du patient. Au contraire, la thérapie de la lignée somatique agit directement sur les cellules que l'on cherche à atteindre (cellules non reproductrices du corps, comme les cellules de la peau, du cerveau ou des muscles), cette manipulation génétique n'affectera que l'individu chez lequel on a effectué ces changements. Pour des questions d'éthiques, seul ce type de thérapie est envisageable dans l'avenir. La thérapie génique ouvre donc de nouvelles voies au traitement à long terme de maladies génétiques telles que la phénylcétonurie dont je vais vous parler. Bien que la procédure ne présente qu'un risque minime, jusqu'à maintenant aucun traitement n'a réussit à traiter une maladie humaine. Quels sont les raisons de cet échec ?

II La Maladie :

1. Définition :

La phénylcétonurie est une maladie génétique héréditaire de la famille des hyperphénylalaninémies (la plus importante de la famille) dont la transmission se fait par mode autosomique récessif. Elle provient d'un trouble de la transformation de la phénylalanine, se trouvant dans le foie et les reins, en tyrosine et est causée par le dysfonctionnement de l'enzyme phénylalanine hydroxylase ou PAH, aidé par un cofacteur, la tetrahydrobioptérine, BH4, chargée de cette transformation. (cf. I, 1) Actuellement, le terme plus général d'hyperphénylalaninémie est préferé à celui de phénylcétonurie.

2. Un peu d'histoire… :

La maladie fut découverte par hasard par monsieur Fölling, un biochimiste. Examinant deux enfants encéphalopathes de la même fratrie, il obtint, en ajoutant du perchlorure de fer à leurs urines, une coloration verte inattendue. Il découvrit qu'elle était due à la présence d'acide phénylpyruvique et démontra le mécanisme de la maladie qu'il appela idiotie phénylpyruvique. Dans les années 1950, Bickel montra qu'en mettant les enfants en régime dépourvu de phénylalanine, on évitait les encéphalopathies.(cf. I,14) Et ce n'est que vers les années 70 que le dépistage systématique fut instauré dans nos pays.(cf. I, 4)

3. Symptômes :

Une trop grande concentration de phénylalanine dans l'organisme et surtout dans le cerveau est plus que mauvais, elle entraîne une encéphalopathie progressive sévère. En effet, cette acide aminé détruit les cellules nerveuses et les gaines entourant les fibres nerveuses, d'où des retards mentaux et un QI pouvant descendre jusqu'à 50 et moins, par conséquent, les enfants non traités, ayant une phénylcétonurie classique ne dépassent pas les premiers stades de développement. D'autres symptômes, tels que de l'hyperactivité, de la microcéphalie, des accès de colère, de l'hypotonie, un rythme cardiaque irrégulier, de l'eczéma et un mauvais développement des fonctions moteurs du patient non traité, nécessitent un placement en institution dès les premières années de vie. A ce stade le traitement est totalement inefficace. Par contre, aucune malformation ni dysmorphie n'est dues à cette maladie, c'est une encéphalopathie «nue». (cf. I, 7) Chimiquement le patient a une concentration élevée en phénylalanine dans le sang et une forte excrétion de phénylalanine, en acide phénylpyruvique et en autres métabolites dans les urines. Ces substances sont à l'origine de l'odeur typique de souris chez le patient non traité. Il est à noter que les enfants traités dès la naissance ne présentent aucun de ces symptômes. Les lésions cérébrales sévères semblent être liées aux multiples conséquences de l'accumulation de phénylalanine telle que : privation en autres acides aminés nécessaires à la synthèse protéique, diminution de la formation ou de la stabilisation des polyribosomes, réduction de la synthèse de myéline et formation insuffisante de sérotonine et de noradrénaline. La phénylcétonurie est un inhibiteur compétitif de la tyrosinase, une enzyme clé de la voie de synthèse de la mélanine. Cette accumulation plus la disponibilité réduite de la tyrosine, provoque l'hypopigmentation typique de la peau et des cheveux. (c.f I, 4) A la naissance aucune anomalie n'est décelable, la concentration plasmatique en phénylalanine peut être normal chez le nourrisson dans toutes les hyperphénylalaninémies mais elle augmente rapidement après la mise en place de nourriture contenant des protéines et elle est habituellement très anormale après 4 jours. (cf. I, 4)

4. Traitements actuel :

La phénylcétonurie classique a été la première maladie héréditaire du métabolisme ou l'on a pu démontrer que les anomalies cliniques pouvaient être prévenues en atténuant l'accumulation du métabolite responsable. Le plus important est de n'avoir qu'une concentration minime (normale ou faible) de cet acide aminé dans le sang et de limiter l'apport en phénylalanine par la nourriture d'une part et la production de métabolites anormaux d'autre part. Cependant cet acide aminé est essentiel, il ne peut être complètement éliminé de l'alimentation car le corps humain ne sais pas comment le fabriquer, il l'ingère grâce aux protéines de sa nourriture. Si le traitement, essentiellement diététique, se fait à un stade précoce l'enfant a de grandes chances de se développer normalement, mais il reste nécessaire de recourir a des produits couvrant les carences en protéines ne contenant qu'un taux de phénylalanine faible voir nul.(cf I, 4) Normalement, comme tout acides aminés, la phénylcétonurie est apportée par l'alimentation et est dégradée par le corps, ce qui n'est pas le cas de la tyrosine, qui est tout aussi essentielle mais qui peut se faire par oxydation de la phénylalanine. Pratiquement tous les aliments contiennent des protéines et par conséquent de la phénylalanine (les protéines sont constituées de chaînes d'acides aminés qui sont cassées lors de la digestion). En temps normal cet acide aminé se transforme en tyrosine à l'aide de l'enzyme PAH et de son cofacteur le BH4 (cf I, 4). Une déficience du BH4 est aussi possible et a les mêmes effets qu'une déficience de la PAH, néanmoins il est important de faire le dépistage de sa déficience car le patient devra être traité différemment. Le déficit en tétrahydrobioptérine, BH4, doit son origine à une déficience de la dihydrobioptérine réductase qui régénère le BH4. Les anomalies du système des bioptérines sont dues à un déficit en cofacteurs ptéridiniques qui engendrent le plus souvent une hyperphénylalaninémie maligne insensible au régime pauvre en phénylalanine. Chez tous les enfants qui présentent une hyperphénylalninémie et une détérioration mentale progressive malgré un diagnostic précoce et une restriction alimentaire, on doit envisager une déficience en tétrahydrobioptérine.(cf. I,12)

Par un suite de transformation on obtient différents produits utilisés par le corps ou bien éliminés par les reins…(cf. figure 1)

(figure 1 : I, 4) …Mais dans le cas de la phénylcétonurie, une mutation dans le gène codant l'enzyme phénylalanine hydroxylase inhibe sa création et son absence dans le foie des malades empêchent la transformation de la phénylalanine en tyrosine. L'accumulation de cet acide aminé et de ses dérivés toxiques provoque une dégradation progressive et irréversible du cerveau.(cf I, 4) (cf. figure 2) (figure 2 : I, 4)

Il faut savoir que les effets de cette maladie ne sont pas tout à fait les mêmes d'une personne à une autre, tout dépend de son âge et à moins grande échelle de son poids et de sa taille. L'enfant de 0 à 6 ans, lorsque les cellules de son cerveau sont encore en développement actif, est le plus en danger, si le traitement n'est pas pris en compte dès les premiers jours de sa vie, l'enfant subira un retard mental sévère pouvant nécessiter son placement en institutions spécialisées. • A la pré adolescence, et à l'adolescence même si le développement du cerveau arrive a sa fin, le traitement doit être poursuivi car les effets d'un taux élevé en phénylalanine sont toujours présents. Ils se présentent sous deux formes différentes: La première se manifeste surtout pendant le développement actif du cerveau, c'est à dire jusqu'à l'adolescence et entraîne la mort des cellules nerveuses et des gaines entourant les fibres nerveuses. Ce long processus n'est pas réversible étant donné que les cellules nerveuses ne se multiplient pas. La deuxième forme est réversible. Elle est due à la diminution de quelques neurotransmetteurs (substances sécrétées par les cellules nerveuses, permettant aux différentes cellules nerveuses de communiquer entre elles). La diminution de ces neurotransmetteurs est à l'origine du changement de comportement et de performance d'un patient ayant ingéré une forte dose de phénylalanine quelques heures auparavant. Le patient devient nerveux, fatigué, il a de la peine à se concentrer, à mémoriser et à faire des tâches complexes. Ces symptômes se normalisent rapidement après la baisse du taux de cet acide aminé. (cf. figure 3)

(figure 3 : I, 4)

• Pour le patient adulte, il est vivement conseillé de continuer si possible le régime à vie, bien que le lien entre la baisse d'intelligence et le taux de phénylalanine chez l'adule ne soit pas scientifiquement prouvé. • Durant la grossesse, il est très important, pour la mère, de pratiquer un régime extrêmement stricte car l'hyperphénylalaninémie maternelle peut provoquer d'une part un risque élevé d'avortement spontané, et, d'autre part, les enfants, exposés aux taux de phénylalanine trop élevé de leur mère par le système de transport placentaire, risquent de présenter des malformations telles que microcéphalies, problèmes de croissance intra-utérin et malformations congénitales, en particulier cardiaques. Il est indispensable de faire un contrôle stricte, avant la conception, du taux de phénylalanine non seulement chez la mère phénylcétonurique (PCU) mais aussi chez la mère hyperphénilalaninémique (ayant un taux modérément élevé de phénylalanine et qui n'avait, jusqu'à la grossesse, pas nécessité de traitement diététique particulier). Ce régime doit commencer près d'un an avant la conception afin de normaliser les taux sanguins.(cf I, 4) La phénylcétonurie maternelle : Auparavant les rares femmes ayant atteint l'âge adulte étaient tellement atteintes par la maladie que le problème de la descendance ne se posait pas. Mais le traitement efficace de la maladie de la phénylcétonurie a eu pour conséquence d'en provoquer une autre, la phénylcétonurie maternelle. En effet, grâce aux traitements actuels les malades traités à temps atteignent l'âge adulte avec des capacités mental et physiques dans les normes, mais si une femme tombe enceinte sans s'astreindre à un régime spécial, des taux légers voir inoffensif pour la mère peuvent devenir gravement dangereux pour l'enfant, car ils provoquent des risques majeurs d'embryo-foetopathie. Les lésions du fœtus sont différentes de celle d'un enfant phénylcétonurique tout simplement parce que in utero l'enfant est protégé par l'activité enzymatique de la mère qui, bien qu'amoindrie, maintient une quantité de phénylalanine inoffensive. Par contre, la mère, ne s'étant pas tenue à ce régime, fait passer par le système de transfert placentaire une quantité excessive de cet acide aminé dès la conception et donc intoxique son enfant et provoquent différents troubles : les taux de phénylalanine inhibent la synthèse en provoquant une dégradations des polysomes, les taux élevés de PAH sont en compétition pour le transport des autres acides aminés aromatiques (tryptophane et tyrosne) ainsi que pour les acides aminés ramifiés, ce qui provoque une carence en acides aminés essentiels à certains moments critiques de l'embryogenèse et enfin ces taux élevés de phénylalanine stoppent la synthèse des neurotransmetteurs. (cf I, 4 et 5) Plus de 90% des enfants nés de mère hyperphénylalninémie sans avoir suivi de régime présentent un retard important et sont porteurs des anomalies génitales citées plus haut. Taux sanguin de phénylalanine recommandés

Taux sanguin de phénylalanine recommandés

Des expériences de thérapie génique pratiquées chez l'animal sont encourageantes, mais ne permettent pas pour le moment des corrections à long terme de l'activité déficiente de l'enzyme. En attendant ce traitement qui s'attaque à la cause de la maladie, l'approche diététique est la seule qui
permette un développement harmonieux de ces patients. Cependant, il est utile de s'intéresser aux capacités plus qu'étonnantes des traitements génétiques.(cf. I, 4)
Le régime (seul traitement actuel): la phénylalanine est un des constituant des protéines, c'est pourquoi il faut limiter l'apport en protéines végétales et animales du patient, il leur est donc interdit de consommer: viandes, laitages, poissons, œufs et céréales. Il leur reste donc les fruits et les légumes, qui possèdent une quantité de phénylalanine variable, les hydrates de carbones (sucre et amidon), les huiles et les margarines sans protéines. Afin de pallier à la carence en protéine, il est indispensable d'utiliser des mélanges spéciaux dépourvus de phénylalanine ... mais qui restent d'un goût fort discutable, ce qui peut provoquer chez l'enfant de l'anorexie.
Durant les 6 premiers mois, le régime ne se fera qu'avec des protéines en poudres sans phénylalanine. (cf. I, 3 et 4)
Les différents degrés d'atteinte de la maladie : (cf. I, 4)
- De 250 à 350 mg/jour autorisés de phénylalanine, le patient a une phénylcétonurie classique (activité de la PAH inf. à 1 %)
- De 350 à 400 mg/jour autorisés de phénylalanine, le patient a une phénylcétonurie modérée (activité de 1 à 5 % et entre 10 et 20 mg/dl)
- De 400 à 600 mg/jour autorisés de phénylalanine, le patient a une phénylcétonurie légère
- Certains patients sous régime libre maintiennent des taux de phénylalanine sanguine inférieurs à 600 mg/jour, ces patients ont une hyperphénylalninémie classique.
Plus le seuil de tolérance est élevé moins le régime de la personne sera stricte.
Dans le cas de phénylcétonurie classique et de déficience en tétrahydrobioptérine, on observe couramment des valeurs supérieuers à 20 mg/dl (taux normal 4 mg/dl), mais dans le cas d'hyperphénylcétonuries bénignes ou transitoires, ces valeurs sont plus basses, mais toujours supérieures aux valeurs contrôles. Les hyperphénylalaninémies bénignes proviennent d'une déficience moins prononcée, alors que l'hyperphénylalaninémie transitoire est causée par un retard de maturation de l'apoenzyme hydroxylase et régresse spontanément, ils peuvent aussi être dus à un régime hyperprotodique. (cf. I, 6)

5. Dépistage :

Les premiers dépistages par l'urine ont été abandonnés car trop tardifs, ils nécessitaient un taux élevé et déjà toxique de phénylalanine.
Le dépistage se fait donc avec le taux de phénylalanine dans le sang, la plupart des nouveaux nés en Amérique du Nord et en Europe subissent automatiquement une détermination de la concentration sanguine en phénylalanine par le test de l'inhibition bactérienne de Guthrie, simple et peu coûteux, afin que le diagnostic et le début du traitement alimentaire de la phénylcétonurie classique soit fixés avant l'âge de 30 jours ce qui permet d'éviter tout risque de retard mental. Si les résultats se trouvent anormalement élevés (sup. à 4 mg/dl), on pratiquera un test qualitatif de fluorométrie et de chromatographie, plus précis mais plus coûteux.

Le premier consiste à ajouter un inhibiteur, la thiénylalanine, dans un milieu de culture bacillis subtillis qui empêche la poussée du bacille. Un papier imprégné de sang est placé dans ce milieu contenant l'inhibiteur. Normalement le bacille ne pousse pas mais s'il existe de la PAH dans le sang testé, le bacille pousse, ce dosage est qualitatif mais grossier. Il est à noter que ce test ne peut être fait sur des enfants sous antibiotiques inhibant la poussé du bacille. L'enfant doit déjà être alimenté par du lait contenant cette acide aminé si l'on veut que le test soit valable. Si, après le test fluorométrique, les résultats sont toujours supérieurs à 4 mg/dl il faudra effectuer un test chromatographique. (cf. I, 5 et 9)

Le diagnostic anténatal de la phénylcétonurie classique est maintenant possible mais il pose un problème d'éthique : le diagnostic prénatal, devant conduire à proposer éventuellement l'interruption de grossesse, est-il légitime pour une maladie traitable ?

6. Fréquence :

Cette maladie est largement répandue parmi les blancs et les orientaux mais est très rare chez les noirs. Elle atteint 1 naissance sur 15000 en Europe (cf. I, 4)

Dépistage à la naissance des Maladies métaboliques héréditaires

en Suisse de 1965 à 1998 selon I 4

7. Le génotype :

Le gène de la phénylalanine-hydroxylase se trouve dans la région q22-q24.1 du chromosome 12 qui est composé de 90 000 nucléotides, plus de 150 mutations ou modifications différentes ont été décrites sur ce gène. Il est apparu qu'il y avait une relation entre le génotype et le phénotype, c'est à dire entre les mutations observées et l'activité résiduelle de l'enzyme. Ceci pose la question de savoir s'il est nécessaire de rechercher par étude génétique les mutations chez tous les patients ayant une phénylcétonurie. Une meilleure connaissance des mutation pour un patient donné permettrait de différencier chez le nouveau-né la phénylcétonurie de l'hyperphénylalaninémie et permettrait de proposer un régime d'emblée mieux adapté à chaque patient, ainsi que de décider de la fréquence des contrôles. Cependant, il convient de remarquer que dans toutes les études épidémiologiques de prédiction du quotient intellectuel, la qualité du régime reste le facteur prédominant et cette qualité du régime est indépendante du génotype. Néanmoins, il existe de grandes variations des taux de phénylalanine parmi les porteurs d'une même mutation ce qui, pour l'instant, limite l'utilité de l'analyse de la mutation au diagnostic prénatal. ( cf. I, 4 et 15) Fréquence du gène : (cf. I, 4)

III La Thérapie Génique :

1. Introduction

Les différents types de thérapies: La première est la thérapie de la lignée somatique ex vivo, par laquelle les cellules cibles sont prélevées du corps, cultivées en laboratoire avec un vecteur, puis réinsérées dans le corps. En général, ce processus est réalisé à l'aide de cellules sanguines, car ce sont les plus faciles à enlever et à réintroduire. Il y a aussi la thérapie de la lignée somatique in situ, consiste à placer le vecteur directement dans le tissu touché. La troisième option est la thérapie de la lignée somatique in vivo, par laquelle le vecteur est injecté dans le courant sanguin et peut trouver et insérer de nouveaux gènes uniquement dans les cellules pour lesquelles il a été spécialement conçu.

Les vecteurs viraux: Il y a deux grandes familles de vecteurs viraux, les rétroviraux (à un seul brin d'ADN) et les adénoviraux (à deux brins), ils sont entourés de couches faites de protéines. Ces vecteurs peuvent soit prendre le contrôle de la cellule pour se reproduire et une fois que la cellule se divise le gène étranger disparaît, où ils peuvent directement s'intégrer dans le génome de la cellule et à ce moment-là reste présent au fur et à mesure des divisions. C'est grâce à son enveloppe extérieur que le virus pénètre les cellules. -Pour les rétrovirus, le virus de la leucémie murine (MRV) est le plus couramment utilisé. -Pour les adénovirus, le virus de l'herpès (VHS) est souvent employé, il a tendance à cibler les neurones mais il n'intègre pas le génome de la cellule hôte.

Les vecteurs non viraux: leur principale avantage est qu'ils sont sûrs et qu'ils ne provoquent aucune maladie ni réaction immunitaire. -Les liposomes, sont de petites molécules de lipides (graisse) ce qui leur permet de fusionner avec les cellules, elles aussi entourées de graisse, sont souvent utilisés. (cf. I, 15 et M, 1a et b)

2. Le transfert de gènes par des virus :

les étapes d'acheminement du gène ‘'guérisseur'' du vecteur à la cellule cible, et les difficultés rencontrées en chemin.

Introduction :

La thérapie génique a donc pour but de transférer des gènes dans les cellules humaines, et pour cela on utilise des vecteurs capables de transférer les gènes thérapeutiques dans l'ADN des cellules : ils doivent êtres sûrs, efficaces, capables de fonctionner dans des cellules qui ne se divisent pas et d'assurer la stabilité du gène thérapeutique. Enfin, leur production doit être fiable et rentable. (cf. I, 15)

Pourquoi des vecteurs viraux ?

Le corps humains a toujours su se protéger des agressions dues à son environnement et, entre autre, de l'introduction d'ADN étranger dans son génome. Les spécialistes ont tout d'abord pensé aux virus qui sont, en effet, d'introduire leur propre matériel génétique, ADN, dans les cellules qu'ils infectent sans être détruits par le système immunitaire. Dans la thérapie génique, ces virus sont transformés avant d'être injectés dans le corps humain. Otés de leur séquence pathogène, nécessaire à leur réplication, il ne reste qu'une capsule vide, une particule virale, inoffensive pour l'homme. La multiplication de ces particules virales étant devenue impossible, il a fallut mettre au point une cellule capable de fabriquer des particules virales. Ces cellules, dites d'encapsidation, sont donc capables d'exprimer les produits nécessaires à la réplication du virus, lesquels s'assemblent afin de constituer des particules virales vides. (cf. figure 1 A) Introduit dans ces cellules, le génome viral modifié pourra alors être transporté sous forme de particules virales complètes(cf. figure 1 B) (cf. M, 1a) (figure 4 : M, 1a)

(figure 4 : M, 1a)

Figure 4. Pour produire des vecteurs viraux, on utilise des cellules modifiées, dites d'encapsidation. A) Ces cellules expriment de façon stable les protéines virales formant la capside. En l'absence de génome viral, elles ne produisent que des particules virales vides. B) L'introduction dans ces cellules d'une construction génétique contenant le génome viral porteur du gène thérapeutique conduit a la formation de particules virales complètes contenant le vecteur.

Les rétrovirus :

Les premiers virus utilisés en tant que vecteurs de transfert ont été les rétrovirus, car ils arrivent à introduire de façon permanente leur patrimoine génétique dans le génome de la cellule qu'ils infectent, ce qui permet donc la présence à long terme d'un gène thérapeutique. La famille des rétrovirus comprend une grande partie de virus dont le génome est un brin d'ARN. Les vecteurs de virus peuvent contenir un ADN exogène de taille assez grande (8 kilobases, Kb), ce qui est suffisamment grand pour contenir la plus grande partie des gènes thérapeutiques et, à l'exception du virus VIH, leur évolution est peu pathogène et donc sans grand risque pour l'homme.

Le plus souvent l'utilisation de rétrovirus se fait ex vivo, c'est à dire que l'on prélève les cellules cibles chez le patient, qu'on les cultive et les transforme génétiquement avec le vecteur avant de les réadministrer (cf. figure 5) (cf. M, 1a) (figure 5 : M, 1a)

Figure 5. Trois types de thérapie génique

La thérapie génique ex vivo consiste à prélever sur le patient les cellules cibles, à les modifier génétiquement avec le vecteur viral porteur du gène thérapeutique, puis à les réintroduire chez patient. Cette méthode est utilisée en particulier pour les cellules sanguines qui sont faciles prélever et à réintroduire. Dans le cas d'une thérapie génique in situ, le vecteur est directement placé au sein du tissu cible. Exemples : infusion de vecteurs adénoviraux dans la trachée et les bronches de patients de mucoviscidose, injection d'un vecteur portant le gène d'une toxine au sein d'une tumeur, ou encore injection d'un vecteur porteur du gène de la dystrophine directement dans le muscle du patient atteint de dystrophine musculaire. Une troisième méthode, appelée in vivo consiste à injecter le vecteur portant le gène thérapeutique directement dans la circulation sanguine devant atteindre spécifiquement les cellules cibles.

Ici figurait un graphique dont le copyright n'est pas disponible

(figure 5 : M, 1a)

Il n'est possible aux vecteurs de pénétrer dans le chromosome cellulaire qu'au moment de la mitose. Il faut donc que les cellules cibles se divisent de manière assez importante au moment de l'exposition au virus. In vivo, l'utilisation de ces vecteurs cause quelques grands problèmes.

Le premier est l'atteinte de cellules cibles, car en thérapie génique le vecteur est injecté par voie sanguine et ne doit atteindre que les cellules que l'ont veut transformer génétiquement, le problème est que les cellules recouvrant les voies sanguines, les cellules endothéliales, expriment naturellement le récepteur MLV. Les vecteurs infectent donc inutilement un nombre important de ces cellules rencontrées en chemin. Il y aurait la possibilité de créer des enveloppes virales qui pourraient ne reconnaître qu'un certain type de récepteur cellulaire mais elles n'augmentent pas la spécificité d'un vecteur par rapport à un type cellulaire donné. C'est pourquoi beaucoup de travaux sont focalisés sur l'amélioration de la spécificité cellulaire des vecteurs et la modification de la protéine d'enveloppe de la particule virale, qui est responsable de la liaison au récepteur cellulaire.

(cf. I, 15 et M, 1a)

En effectuant un changement de conformation, cette protéine permet la fusion des membranes virales et cellulaires et la pénétration du core du virus, la partie contenant l'information génétique, dans le cytoplasme de la cellule cible.(cf. figure 6 (M, 1a)) (cf. M, 1a)

Ici figurait un graphique dont le copyright n'est pas disponibleFigure 6. Comment un virus, ou un vecteur viral, pénètre dans les cellules.

A) Pour infecter une cellule, la particule virale se fixe d'abord à la membrane cellulaire. Les gènes viraux sont libérés dans le noyau et, qu'ils soient intégrés ou non au génome cellulaire, ils utilisent la machinerie de réplication de la cellule pour produire de nouvelles particules virales. Ces dernières pourront aller infecter d'autres cellules.

B) Lorsque le virus est modifié pour être utilisé comme vecteur de transfert, les gènes codant pour les protéines virales sont remplacées par le gène thérapeutique. Ce vecteur pénètre dans la cellule de la même façon que le virus naturel. Il permet la synthèse de la protéine thérapeutique, sans production de particules virales.

Une des stratégie utilisée consiste à remplacer une partie du virus par un ligand* ou un anticorps qui ne reconnaisse qu'un certain type de récepteur cellulaire, c'est pourquoi toute une variété de récepteurs a été ciblée, mais malgré une liaisons spécifique entre le vecteur viral et la cellule, le transfert des gènes thérapeutiques est beaucoup trop faible et ce dans toutes les expériences effectuées. Tout d'abord parce que l'ajout d'un ligand ou d'un anticorps en transformant la protéine virale empêchent la fusion des deux membranes. Une autre technique, dite d'ancrage, consiste à insérer dans l'enveloppe viral un ligand reconnaissant ‘‘un composé de la matrice extracellulaire''(ensemble de protéines fibreuses extracellulaires qui facilite l'adhésion des cellules et leur organisation en tissus le collagène ou l'élastine) et qui entoure les cellules cibles. Elle permet de concentrer le vecteur à proximité des cellules. La fibronectine et le collagène, le premier étant présent dans la matrice extracellulaire normale et l'autre dans les zones endommagées, peuvent être utilisés comme ligand.

Ligand : Molécule qui se lie à une protéine jouant le rôle de récepteur. C'est le cas par exemple des hormones et des facteurs de croissances Le deuxième problème est dû au rétrovirus du type MLV lui-même. Il est incapable de transduire dans des cellules ne se divisant pas et la majeure partie des cellules cibles ne se multiplient pas très activement in vivo. D'autres rétrovirus, les lentivirus, comme le VIH, sont capables d'infecter ce type de cellules cible mais leur utilisation à des fins thérapeutiques présente trop de risques car elles pourraient se recombiner et créer un nouveau virus pathogène. (cf. M, 1a)

Certaines recherches se penchent sur l'utilisations de systèmes hybride ; avec une partie du génome

VIH (sans les gènes pathogènes du virus) et un vecteur rétroviral dont l'enveloppe serait non-VIH. Même si ces recherches semblent prometteuses elle ne sont, jusqu'à maintenant, qu'au stade théorique (sources datant de début 99).

Une autre difficulté est d'obtenir une expression à long terme du gène thérapeutique et ce à un taux approprié. Que le vecteur soit un rétrovirus, un adénovirus ou un vecteur synthétique il est très difficile de garder ces nouveaux gènes longtemps dans le corps. En effet, plusieurs facteurs empêchent le maintient de l'expression du gène même après leur transfert; la cellule reconnaît comme étrangère et inactives les séquences régulatrices du gène thérapeutique, et même si elles restent actives, le système immunitaire détruit la cellule infectée et les gènes étrangers qu'elle exprimait. Une solution serait d'utiliser les séquences de la cellule, ce qui pourrait permettre une expression plus stable et à plus long terme du gène que celle obtenue avec des séquences virales mais ce travail est difficile et même si les éléments de régulation naturel sont utilisés, ils peuvent ne pas fonctionner correctement sans leurs propres signaux et mécanismes de contrôle agissant normalement dans la cellule. (cf. I, 15 et M, 1a)

Même si de grands progrès sont réalisés dans ce domaine, il reste à améliorer l'expression stable, à long terme et à un niveau adéquat d'un gène in vivo dans plusieurs types de variétés cellulaires.

Un autre problème est l'expression régulable du gène. Prenons l'exemple du gène cible de l'insuline, celui-ci ne s'exprime pas à tout moment de la même manière, il répond aux signaux physiologique du corps. En reprenant cette idée, l'idéal serait de faire appel à des séquences répondant aux signaux physiologiques du corps ou à d'autres produits contrôlant le niveau d'activité du gène.

Les réactions immunitaires posent aussi des difficultés, les défenses de notre système contre les corps étrangers fonctionnent en analysant l'enveloppe du corps et non pas ce qu'il contient, et donc la plupart des corps étrangers se font directement détruire ce qui est aussi le cas des virus et des enveloppes virales contenant un gène thérapeutique. Notons aussi que si le produit est injecté à trop forte dose de violentes réactions immunitaires se produiraient et enfin, nos anticorps pouvant mémoriser les particules virales, celles-ci se feront reconnaître et donc détruire plus rapidement par notre système immunitaire dès la deuxième injection. Il ne sert donc à rien d'injecter plusieurs fois

le même vecteur viral sur un patient, car le gène n'a pratiquement aucune chance de pouvoir arriver à destination. (cf. M, 1a)

La fabrication industrielle du vecteur est un autre problème, il doit être sûr et rentable. Les vecteurs rétroviraux ne peuvent être fabriqués que dans des cellules vivantes, ce qui n'est pas facile à manipuler si l'on tient à garder de bonnes pratiques de fabrication; pendant la fabrication industrielle, un vecteur rétroviral peut se reconstruire par recombinaison et former un rétrovirus capable de se répliquer, un RCR. Ces vecteurs sont produits dans des cellules contenant le matériel nécessaire à l'encapsidation du virus déficient et puisque toutes les cellules mammifères ont des virus endogènes (internes), d'autres séquences virales, potentiellement pathogènes, peuvent s'intégrer à l'enveloppe. (cf. M, 1a)

Les vecteurs rétroviraux pouvant s'implanter de manière aléatoire dans la cellule cible peut être problématique s'ils s'intègrent dans un gène important et l'inactivent, comme un gène superviseur de tumeur par exemple, ce qui pourrait rendre la cellule cancéreuse.

Le choix de la cellule d'encapsidation est aussi très important. En effet, les cellules d'encapsidation murines fabriquent des vecteurs qui se font détruire par le système immunitaire ce qui rend certe le vecteur inoffensif mais qui raccourcit sa demi-vie et par conséquent, l'efficacité du transfert de gène. (cf. M, 1a)

Si l'on veut des vecteurs rétroviraux qui ne se fassent pas reconnaître, il faudrait des cellules murines modifiées ou des cellules d'encapsidation non murines. La deuxième solution remet sur la table le problème de la recombinaison et la fabrication de RCR pouvant être pathogènes.

Les adénovirus :

Les rétrovirus ne sont pas les seuls virus utilisables en thérapie génique, les chercheurs s'intéressent aussi aux vecteurs adénoviraux, qui grâce à leur propriétés biologiques, sont de très bon postulants pour le développement de vecteurs de transfert in vivo et in situ ; ils sont d'une grande taille ce qui permet d'y intégrer de grandes séquences d'ADN (jusqu'à 35 kb), ils peuvent infecter un grand nombre de cellules (près de 100% sur les test in vitro), ils infectent sans grand problèmes des cellules ne se divisant pas et peuvent être produits à des concentrations élevées. L'inconvénient est qu'ils provoquent de fortes réactions inflammatoires et immunitaires. Il faudrait donc concevoir des vecteurs n'exprimant plus de gènes viraux. Malheureusement, les tests réalisés sur les animaux et les primates donnent des résultats contradictoires. Cependant, ils ont permis de mettre en évidence que l'immunogénécité (capacité d'une substance à susciter une réponse immunitaire), la stabilité de l'expression génique et la persistance in vivo des guetless vectors (vecteurs sans gènes viraux) varient en fonction de plusieurs facteurs: l'origine exacte du vecteur, la nature du tissu cible et la nature du gène thérapeutique inséré. De plus les résultats obtenus chez l'animal ou le primate ne reflètent pas toujours ce qui se passe chez l'homme: les réactions immunitaires déclenchées par le vecteur chez l'homme ne sont pas obligatoirement déclenchées chez l'animal et vice versa. Par ailleurs, il y a un grand inconvénient à enlever trop de gènes viraux car certaines séquences virales protègent les cellules qui expriment le vecteur de la surveillance immunitaire, sans oublier qu'elle peuvent contenir des régions activatrices aidant à maintenir la stabilité du génome viral dans la cellule. (cf. I, 15)

La mise au point d'une combinaison de gènes viraux contenant des immunosuppresseurs (où l'immunogénicité est supprimée) est nécessaire. Ainsi nous aurions des vecteurs adénoviraux peut toxiques, sans réponse immunitaire et surtout pouvant être administrées de façon répétée. Mais étant donné que ces vecteurs ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule cible, ils disparaissent en fur et à mesure des divisions cellulaires. Ce type de vecteur non immunogène serait idéal mais vu le nombre de difficultés rencontrées pour sa création, des solutions intermédiaires sont à envisager. (cf. M, 1a)

Les autres vecteurs viraux :

Un autre virus à ADN, le AAV(adeno-associated virus), est utilisé en clinique. Ce virus non pathogène est naturellement déficient et il a donc besoin d'un adénovirus ou du virus de l'Herpès pour se répliquer. La spécificité de ce virus est qu'il est le seul virus de mammifère connu pouvant s'intégrer spécifiquement à une seule région du génome de la cellule, le bras court du chromosome 19, mais ce virus perd cette caractéristique une foi transformer en vecteur de transfert. Un autre point fort de ce virus, mais toujours lorsqu'il est pris à l'état naturel, est de pouvoir s'intégrer dans des cellules ne se divisant pas. Une foi transformer, il les infecte mais n'arrive pas à attaquer le génome. De plus, ce virus doit être fabriquer en grand nombre puisqu'il ne peut contenir des séquences d'ADN inférieurs à 4,8 kb et leur fabrication reste limitée car les cellules d'encapsidation idéales n'ont toujours pas étés développées. Les avantages de ce vecteur sont donc inexploitables en clinique pour le moment mais sont toujours à l'étude car prometteurs et ne présentant que peu de risques.

Deux autres vecteurs qui intéressent les chercheurs sont celui de l'Herpès qui est capable de transduire les cellules du système nerveux et les systèmes hybrides, combinant un vecteur adénoviral, pouvant atteindre des cellules n'acceptant que ce type de vecteur, et un vecteur rétroviral qui lui est plus sûr et permet d'insérer dans le génome d'une cellule qui ne se divise pas son propre ADN. (cf. M,1a)

Conclusion :

A l'heure actuelle les vecteurs viraux sont loin d'être au point et posent encore bien des problèmes: Comment assurer l'expression à long terme du gène thérapeutique ? Comment en obtenir une régulation physiologique de son expression ? Comment contourner les défenses immunitaires in vivo ? Comment produire d'un façon rentable et fiable les vecteurs dont nous avons besoins ? Tous ces problèmes non résolus sont l'explication de l'absence de réussite clinique notable.

Figure 7 : Exemples de différents vecteurs :

(figure 7 cf. M, 1a)

2 : Vecteurs synthétiques :

Ici figurait un graphique dont le copyright n'est pas disponible

figure 8 : Le périple d'un vecteur synthétique.

En présence du transporteur lipidique, l'ADN est condensé en une particule très compacte, chargée positivement, qui peut interagir avec la membrane cellulaire qui, elle, présente des charges négatives. Après avoir pénétré dans la cellule grâce au repliement de la membrane (endocytose), le complexe vecteur/ADN doit s'échapper des endosomes. Sinon, il sera déversé dans les lysosomes et hydrolyse par leurs enzymes. Une fois ce piège évité, il doit diffuser à travers le cytoplasme et entrer dans le noyau. L'expression du gène générera la molécule thérapeutique qui pourra être de nature ribonucléique ou protéique.

(figure 8 : cf. M, 1b)

Les vecteurs synthétiques ont plusieurs atouts. Leur production est simple et sûre, ils sont stables et peuvent contenir des constructions génétiques de grande taille. Mais si leur efficacité in vitro est satisfaisante, les résultats in vivo sont décevants, sans doute parce que la connaissance des mécanismes impliqués reste insuffisante. Quelques études cliniques ont été lancées pour une utilisation locale. (cf. I, 15)

Pourquoi des vecteurs de synthèse ?

Comme dit plus haut, les virus possèdent la capacité d'atteindre leur cellule cible, d'y pénétrer et d'y exprimer leur matériel génétique. Pour les utiliser comme vecteur de transfert, pour des raisons de

sécurité, il faut les modifier de telle sorte qu'ils deviennent incapables de se multiplier. A partir de ces objets vivants, l'homme à réussit à faire des vecteurs viraux dits défectifs. Or, les qualités de ces derniers s'éloignent significativement de celles du virus d'origine : ils perdent certaines propriétés, et peuvent même en acquérir de mauvaises. C'est d'ici que l'idée de créer des vecteurs purement chimiques, dans lesquels les éléments fondamentaux de la stratégie virale sont remplacés par des composants de synthèse est apparue. Ce qui permet d'éviter toutes les contraintes liées à la fabrication de vecteurs viraux. (cf. I, 15 et M, 1b)

De quoi ces vecteurs sont-ils faits, comment fonctionnent-ils et quels sont les problèmes rencontrés?

Déroulé, un petit gène, une molécule d'ADN de quelques de milliers de paires de bases, est d'une longueur semblable à celle d'une cellule. Difficile pour le premier de pénétrer la seconde. D'autre part, l'ADN est une molécule chargée négativement. Les virus compactent fortement l'ADN, grâce à des protéines riches en acides aminés chargés positivement, les histones. Voilà pourquoi la plupart des vecteurs de synthèse sont des lipides, des peptides ou des polymères chargés positivement, dits cationiques. Comme les histones, ils peuvent à la fois condenser l'ADN et donner une charge positive au tout. Ce qui leur permet d'interagir avec les membranes cellulaires qui, elles, sont positives. (cf. figure 6)

Les interactions de l'ADN avec un vecteur, qu'elle qu'en soit sa nature, ne sont pas prévisibles. La plupart des équipes mélangent de manière empirique vecteur et acide nucléique : il se forme un complexe qui contient, en général, plusieurs molécules d'ADN. De plus, ces complexes vecteur cationique/ADN ont tendance à se détériorer. Les complexes ont un diamètre de 50 à 150 nanomètres. Seule une condensation contrôlée de l'ADN permettrait la formation de particules ne renfermant qu'une seule molécule d'ADN. Cela réduirait leur diamètre à une vingtaine de nanomètres, ce qui faciliterait la pénétration dans les cellules et leur noyau. Par ailleurs, le fait que l'ADN soit compacté le protège des enzymes capables de le dégrader, les nucléases. (cf. M, 1b)

Pour faire rentrer ces complexes transfectants, avant de pénétrer dans une cellule, certains virus interagissent avec des protéines sucrées anioniques, chargées négativement, qui se trouvent sur la membrane plasmique. Et lorsque ces complexes transfectants ont une charge positive, il semble qu'ils utilisent ces molécules de surface pour se fixer sur la cellule. Ces interactions électrostatiques leur permettent ensuite d'y pénétrer. In vitro, l'étape de pénétration dans la cellule ne pose pas de problème, cependant, in vivo, leur efficacité chute considérablement et atteint souvent le zéro.

Ainsi, après injection par voie intraveineuse de ces complexes chargés positivement, on constate que le transfert de gènes s'effectue surtout vers les cellules des poumons et du foie.

Cette distribution montre que les complexes transfectants s'agrègent en particules de grande taille, car ils interagissent sans doute avec des protéines du sang, et ne peuvent donc pas quitter de manière efficace le système vasculaire: les particules sont retenues par les filtres naturels que constituent les poumons et le foie et pénètrent dans les premières cellules qu'elles rencontrent dans ces organes. (cf. M, 1b)

Une fois franchis les premiers filtres, on cherchera le plus souvent à éviter la dissémination de l'ADN thérapeutique dans l'ensemble de l'organisme: il faut le conduire vers des cibles spécifiques. Pour cela, tout comme dans le cas des vecteurs viraux, on peut greffer sur le transporteur des ligands, qui peuvent être très variés (sucres, peptides, hormones...). Ils ont pour intérêt d'avoir une interaction transporteur/cellule très spécifique, ce qui n'est pas le cas des charges ioniques. Par exemple, des protéines sucrées complexes permettent une entrée dirigée vers les cellules du foie.

Les cellules absorbent les éléments du milieu extérieur par endocytose: leur membrane se replie jusqu'à former une vésicule, l'endosome. Les complexes de transfection profitent de ce mécanisme pour pénétrer leurs cibles cellulaires. L'intérieur de l'endosome s'acidifie progressivement, puis fusionne avec une autre sorte de vésicule, appelée lyposome. (cf. I, 15 et M, 1b)

Ce dernier contient des enzymes qui dégradent son contenu. Une fois dans l'endosome, les complexes doivent donc absolument s'en échapper avant d'être déversés dans les lysosomes (organites déversant des enzymes qui digèrent les particules cellulaires) et de subir leur attaque. On associe donc aux vecteurs synthétiques des molécules fusiogènes, qui déstabilisent les membranes

de l'endosome, et leur permettent de s'échapper. Afin que l'activité fusiogène ne se révèle qu'après l'entrée dans l'endosome, on choisit des molécules dont l'activité ne s'exerce que lorsque le milieu s'acidifie. Les vecteurs lipidiques sont ainsi ajoutés à un lipide particulier surnommé DOPE (pour

di-oleoyi-phos-phatidyl-éthanolamine). Les autres types de vecteurs, peptidiques, polymériques..., peuvent être associés à des peptides fusiogènes, comme celui de la grippe et permet d'augmenter d'environ cent fois l'efficacité de la transfection.(cf. I, 15)

Hybridation du vecteur synthétique à un adénovirus....

On peut aussi utiliser des particules virales, telles que les adénovirus, qui arrivent de manière assez efficace à échapper à la dégradation intracellulaire. En utilisant des adénovirus défectifs associés à des complexes de transfert, l'efficacité du transfert de gène peut être multipliée par 1000. Mais l'avantage du tout synthétique est alors perdu.(cf. I, 15 et M, 1b)

Une fois dans la cellule :

Une fois dans le cytoplasme, encore faut-il que l'ADN atteigne le noyau de la cellule. Introduit dans des cellules en croissance (en particulier des cellules en culture), l'ADN pénètre dans le noyau au cours de la division cellulaire, lorsque l'enveloppe nucléaire est disloquée. Mais dans les cellules au repos, état dans lequel se trouve la plus grande partie des cellules de l'organisme, l'enveloppe nucléaire constitue une barrière qui ne laisse passer, par diffusion, que les molécules de diamètre inférieur à 9 nm. Les molécules dont la taille fait entre 9 et 25 nm, peuvent pénétrer dans le noyau par les pores de la membrane nucléaire, mais la plupart des complexes de transfert mesurent plus de 25 nm. Cette étape du transport nucléaire est aujourd'hui la plus difficile à résoudre. (cf. M, 1b)

Autre problème, si le vecteur reste associé à l'ADN jusque dans le noyau, il faut s'assurer que sa présence ne s'associe pas avec le gène introduit, des complexes à base de polymères (des polyéthylènimines) inhibent peu ou pas la transcription du transgène. En revanche, les transporteurs cationiques à base de lipides inhibent cette transcription lorsqu'ils sont trop chargés positivement.

(cf. M, 1b)

Le problème du maintient durable de l'expression du gène :

Au-delà des problèmes de vectorisation de l'ADN dans les cellules cibles, d'autres éléments se révèlent cruciaux, comme le maintient durable du gène thérapeutique dans les cellules, nécessaire pour le traitement d'une maladie génétique, et la régulation de son expression selon les besoins de l'organisme. Pour s'assurer du maintien du gène, une première solution, efficace, est d'intégrer le gène dans le génome de l'hôte. Dans l'idéal, cette intégration devrait être ciblée, ce qu'on est encore loin de savoir faire. Une autre voie de recherche est de maintenir la construction génétique. l'ADN, arrivé au noyau mais non intégré au génome de l'hôte, se répliquera au cours des divisions de la cellule. Enfin, troisième possibilité, l'introduction dans la cellule cible de mini-chromosomes artificiels (MAC en anglais), stables et se répliquant aussi de manière autonome. Dans ce dernier cas, le gène pourrait être transféré avec tous ses sites de régulation, qui peuvent parfois s'étendre sur plusieurs fois la longueur du gène. Son expression serait alors contrôlée par la cellule de façon naturelle. C'est là un atout potentiel majeur des vecteurs synthétiques: il n'y a quasiment pas de limite à la taille de l'ADN transfecté. Si les vecteurs viraux ne peuvent pas dépasser la trentaine de kilobases, leurs homologues synthétiques peuvent tout à fait transfecter (in vitro) un gène accompagné de toutes ses séquences de régulation. (cf. M, 1b)

Avantages par rapport au vecteurs viraux et conclusion :

A l'heure actuel, l'intérêt des systèmes non viraux réside dans la simplicité de leur préparation, leur stabilité et leur pureté. Leur nature chimique implique que les chercheurs contrôlent bien la structure des transporteurs associés à l'ADN. A terme, ils seront peut-être intéressant pour une utilisation locale. Cependant, le fossé qui sépare les résultats in vitro et in vivo montre les limites du modèle expérimentale des cellules en culture dans le cadre de la thérapie génique.

Nathalie Tafer Gr. 406

La Phénylcétonurie

cf. M, 1a: voir dans le magasine 1 article a

cf. I, 13 : voir le site internet numéro 13

IV Analyse et Conclusion :

La phénylcétonurie est une maladie grave, mais dont les symptômes peuvent être évités, le régime est certe contraignant et coûteux mais il est faisable à condition d'avoir de la volonté de la patience et du courage, surtout pour les parents qui pourraient être tentés d'abandonner la grossesse, et qui, le cas contraire, doivent apprendre à donner des repas adaptés et à calculer chaques grammes de nourriture. Aussi pour l'enfant qui, malgré les tentations, doit savoir s'abstenir devant la grande majorité des aliments et ce en tout cas jusqu'à l'âge adulte.

Les thérapies géniques sont intéressantes mais depuis environs deux, il a été interdit de pratiquer des tests sur l'être humain et donc aucune grande avancée n'a pu être faite dès lors(source datant de 1999 cf. annexes), cependant il reste intéressant de continuer de parler des différentes possibilités qu'offrent ce système.

Comme on l'a vu plus haut, les raisons de l'échec des traitements de thérapie génique sont nombreuses et plutôt difficiles à résoudre, les plus grands problèmes sont :

Les vecteurs ; il n'a pas été jusqu'à maintenant possible de trouver un vecteur assez efficace, que ce soit dans les vecteurs viraux, ou dans les vecteurs synthétiques. Le choix du vecteur n'est pas facile: faut il un vecteur viral ou un vecteur synthétique ? Peut-être l'idéal serait un vecteur hybride, réunissant les qualités de différents vecteurs comme le VIH qui peut aussi s'intégrer dans les cellules ne se reproduisant pas. Lié à un rétrovirus, il pourrait être le parfait vecteur, car il n'y a plus de risque de recombinaison. Il faut aussi avoir des vecteurs qui ciblent les cellules voulues sans pour autant que ces vecteurs ne se dispersent dans le corps et ne s'intègrent dans les cellules qui ne sont pas visées.

Le maintient de l'expression du gène est un autre grand problème, car, quel que soit le vecteur utilisé il y a chaque fois d'autres problèmes qui s'ajoutent.

Tout ceci n'est qu'un échantillon des problèmes restant encore en suspends que posent les traitements de thérapie génique et qui, au fur et à mesure que l'on essaye de les résoudre, en révèlent d'autres. Plus les chercheurs avancent plus les zones d'ombres se multiplient. La thérapie génique est encore loin de la phase de traitement sur patient, elle a encore des progrès à faire en ce qui concerne le type de vecteurs, la sécurité des vecteurs, l'expression à long terme du vecteur, ... A croire que Mère Nature nous a criptés de telle sorte que seule elle ne pourra jamais comprendre !

Il est indéniable que la thérapie génique reste pour l'instant bien loin de pouvoir guérir beaucoup de monde. Peut-être que pour l'instant en ce qui concerne le malade, la meilleure chose serait de ce concentrer activement sur les produits actuels, les rendre peut-être moins mauvais pour éviter les problèmes d'anorexie chez l'enfant. Cependant, la thérapie génique est le seul espoir de guérison à long terme, et l'apparition de thérapies géniques fiables, sûres et efficaces sauveraient, en tout cas amélioreraient la qualité de vie, de nombreuses personnes, des personnes atteintes de phénylcétonurie mais aussi de mucoviscidose, d'hémophilie en ce qui concerne les maladies génétiques mais aussi les tumeurs et les cancers qui pourraient théoriquement aussi être soignés par thérapie génique.

Il est tout à fait justifieé que les expériences génétiques aient été interdites sur l'homme, mais cela reste dommage car sans les expériences, avec pour seuls informations celles données par les tubes à essais, nous sommes encore loin de pouvoir arriver à des résultats dans un futur proche, cependant il est important de se rappeler les limites éthiques du problème, car tant que l'on reste dans des types de thérapies germinales dans un but thérapeutique, il n'y a pas de grands problèmes mais, bien qu'on en soit encore très loin, attention à ne pas déraper vers une orientation qui viserait à s'attaquer aux cellules germinales...

V Bibliographie :

(les différentes illustrations proviennent du magasine La Recherche numéro 315 et les dessins du site internet www.pcu.ch)

Magasines:

1) La Recherche n° 315 12.1998 M.W. French Anderson /Antoine Kichler et Danos Olivier

2) La Recherche n° 332 06.2000 Daniel J. Kevles/ F. Rechemann et Christian Gautier

3) La Recherche n° 346 10.2001 diff auteurs

4) La Recherche n° 348 12.2001 diff auteurs

Sites interets :

1) www.med.univ-rennes1.fr/etud/pediatrie/erreurs-metabolisme.htm

2) www.inrp.fr/Acces/biotic/gpe/dossiers/ phenylcetonurie/accueil.htm

3) autisme.france.free.fr/docs/f4.htm

4) www.pcu.ch/

5) http://www.hc-sc.gc.ca/hppb/soinsdesante/pubs/clinique/pdfs/s2c17f.pdf

6) www.john-libbey-eurotext.fr/articles/ mtp/4/6/414-8/fr-resum.htm

7) www.inrp.fr/Acces/biotic/gpe/dossiers/ phenylcetonurie/html/modulateurs.htm

8) www.revogan.be/fr/producten/pku_quoi.htm

9) www-timc.imag.fr/Olivier.Cohen/college/Enseignement/ genformclin/depistneonat.html

10) www.enseignement.polytechnique.fr/ biologie/annales/ANNALE3/X85.HTM

11) afatta.qc.ca/horiz3.htm

12) www.med.univ-rennes1.fr/etud/pediatrie/ phenylcetonurie.htm

13) www.unifr.ch/nfp37

14) fr.encyclopedia.yahoo.com/articles/so/so_426_p0.html

15) orphanet.infobiogen.fr/data/patho/FR/fr-PKU.html

VI Remerciements :

-Je voudrait tout d'abord remercier mes deux grands frères qui ont su m'aider pour la mise en page et les quelques « problèmes » techniques et informatiques et qui ont surtout réussit à arrêter de m'embeter pendant ces quelques dernières semaines.

-Je voudrait aussi remercier mon petit frère, bien qu'il soit plus grand que moi, qui lui a carrément su m'encourager dans ce travail, ce qui est assez incroyable mais vraiment gentil de sa part.

-Il y a aussi M. Lombard qui a su garder son sang froid malgré les problèmes, involontaires, que j'ai pu causer.

-Sans oublier Laure Vieux car elle m'a défendue, supporter et m'a encourager dans ce nouveau projet.

-Mon chat qui a tenu à veiller jusqu'à tard le soir pour me tenir compagnie.

-Moi qui malgré tout pleins d'épreuves à réussit à mener jusqu'au bout ce projet.

-Dieu et Bill Gates pour ses bugs , petit clin d'oeil sans grande importance à l'un de mes frères et à Laure.

Texte récents sur la thérapie génique

Premier succès pour la thérapie génique Grave déficit immunitaire soigné chez des "bébés bulles"

Paris. La thérapie génique a connu son premiersuccès. Grâce à ce nouveau mode de traitement, des médecins parisiens ont pu soigner un grave déficit immunitaire chez des nourrissons. Cette infection oblige les bébés à vivre dans une bulle stérile pour éviter les microbes. Les deux premiers "bébés bulles", traités à 8 mois et 11 mois,, ont pu rentrer chez eux sans aucun traitement. Ils jouissent depuis plus d'une année "d'un système immunitaire normal, sans effets secondaires indésirables", explique Alain Fischer, co-auteur de l'étude, dans la revue américaine "Science" de vendredi.

Première preuve tangible

Cette restauration du système immunitaire a été confirmée par les vaccinations contre la diphtérie, la poliomyélite et le tétanos: les nourrissons ont réagi normalement en produisant des anticorps contre ces maladies. L'équipe prévoit de traiter six autres bébés cette année et s'intéresse à des maladies similaires.

Ce succès apporte la première preuve tangible de l'efficacité de la thérapie génique. Au total, cinq bébés ont bénéficié du traitement, dans quatre cas avec succès. Pour le dernier cas, les chercheurs sont dans l'attente et refusent pour l'heure de se prononcer.

"Jamais jusque là une correction complète des anomalies de la maladie n'avait été obtenue pour d'autres maladies", ajoute le professeur Fischer. Les enfants "devront être surveillés toute leur vie pour s'assurer de leur bonne santé et contrôler le succès à long terme du traitement", relève-t-il toutefois.

Maladie rare

L'immunodéficience combinée sévère est une maladie rare, caractérisée par l'absence totale de cellules de défense. Elle laisse le malade à la merci de la moindre infection, provoquant sa mort en l'absence de greffe de moelle osseuse ou de l'abri en chambre stérile.

Le traitement consistait à introduire un gène "sain" dans des cellules sanguines, afin de corriger le défaut génétique. Les cellules modifiées ont proliféré rapidement, ce qui a permis de reconstituer le stock de globules blancs, de lymphocytes T et d'autres cellules de défense de l'organisme.

Premier succès d'une thérapie génique

Deux enfants nés sans défenses contre les maladies et obligés de vivre dans des bulles stériles ont été guéris grâce à une thérapie génique. Un premier succès pour ces traitements jusqu'ici peu concluants.

France 28/04/2000 - Deux enfants forcés de vivre dans des bulles stériles à l'hôpital parce qu'ils étaient nés sans défenses immunitaires ont été rendus à la vie normale grâce à une thérapie génique. En introduisant une copie en bon état du gène défectueux dans l'organisme de deux bébés de 8 et 11 mois, en effet, des chercheurs français sont parvenus à guérir l'immunodéficience combinée sévère (DICS XI, en jargon médical) dont ils étaient atteints. Il s'agit là d'un premier succès pour les thérapies géniques, une approche qui. a jusqu'ici connu plus de déboires que de résultats encourageants.

Les enfants atteints de DICS XI sont privés d'un gène qui permet à certaines cellules clés de leur système immunitaire de se reproduire et d'attaquer les corps étrangers. Résultat :

leur immunité étant inexistante, ils sont incapables de se défendre contre la moindre maladie et doivent vivre dans des environnements stériles tant qu'ils n'ont pas subi une greffe de moelle osseuse, une opération qui demeure difficile et risquée.

Les chercheurs français, dirigés par Alain Fischer, de l'Hôpital Necker, à Paris, ont introduit une copie en bon état du gène défectueux chez ces enfants dans un rétrovirus. Ils en ont ensuite infecté les bébés à plusieurs reprises, sur une période de trois jours. Deux semaines plus tard, on détectait déjà de nouvelles cellules porteuses du gène corrigé et un nombre croissant de cellules immunitaires fonctionnelles. Aujourd'hui, après plus de 11 mois, les deux enfants vivent à

la maison et ont des défenses immunitaires comparables à celles d'enfants de leur âge. Divers vaccins ont aussi administrés avec succès.

-Un des problèmes des thérapies géniques en général consiste à faire en sorte que les gènes corrigés se substituent au gènes fautifs dans toutes les cellules du corps. Dans le cas de DICS XI, la maladie elle-même semble contribuer au succès de la thérapie. Comme les cellules défectueuses ne se reproduisent guère, celles qui sont porteuses du gène corrigé n'ont aucun mal à se multiplier, supplantant éventuellement les autres: Le traitement de la maladie a donc été efficace bien qu'une poignée seulement de cellules porteuses du gènes correct aient pu être introduites dans l'organisme.

Philippe Gauthier

Non aux humains génétiquement modifiés

Les chercheurs eux-mêmes s'effraient des expériences génétiques. Un comité d'experts considère que la technologie n 'est pas au point et que, léserait-elle, la société n 'aurait pas la sagesse nécessaire à son usage.

États-Unis

19/09/2000 - II serait dangereux et irresponsable de laisser les chercheurs effectuer des manipulations génétiques capables de se transmettre d'une génération à l'autre et ce, même si le but visé consiste à prévenir des maladies héréditaires. C'est du moins ce que conclut un comité de la prestigieuse Association américaine pour l'avancement des sciences, qui compte 146 000 chercheurs dans ses rangs. Les experts rappellent que la technologie n'est ni sûre, ni efficace et que même si elle l'était, il n'est pas certain qu'elle serait utilisée de manière équitable. Mieux vaut donc s'abstenir pour l'instant.

Jusqu'ici, la recherche sur les thérapies géniques s'est surtout orientée vers la réparation des gènes somatiques. Ces réparations ne sont pas transmissibles d'une génération à l'autre. Mais divers laboratoires travaillent maintenant sur des modifications génétiques transmissibles, qui permettraient en théorie de retirer les gènes de certaines maladies héréditaires qui affectent plusieurs familles. Cette technique pourrait aussi ouvrir la porte'à la création de bébés plus beaux, plus intelligents ou plus athlétiques.

La tentation est donc forte. Mais le rapport souligne que les médias ont tendance à ne rapporter que les succès des manipulations génétiques et du clonage. Or, derrière chaque réussite, il y a des bataillons d'animaux difformes, avortés ou nés avec des anomalies génétiques fatales. Les laboratoires se gardent bien d'attirer l'attention sur ces échecs. « Cette technologie est hautement inefficace et sa sûreté n'est pas démontrée, soulignent les experts. Ce sont là des barrières techniques majeures à son application sur les humains. »

Et même si la technologie était au point, un sérieux problème moral se poserait : qui aurait accès à cette technologie, et à quel prix? Et qui aura le pouvoir de décider? Si seuls les riches peuvent se permettre des bébés génétiquement améliorés, on risque de créer un gouffre sans précédent entre les classes aisées et le reste de la population, avec des conséquences sociales potentiellement explosives. Les experts croient que nos sociétés ne sont tout simplement pas encore capables d'utiliser cette technologie « de manière équitable, juste et respectueuse de la dignité humaine » et suggèrent que l'on s'en abstienne pour l'instant.

Philippe Gauthier

Semaine du 24 janvier 2000

Flash Science Halte à la thérapie génique

Les autorités américaines ont rendu leur verdict : la thérapie génique doit cesser pour un temps. Cette conclusion, prévisible, survient au terme de l'enquête sur le décès d'un patient, en septembre. Un nombre désolant d'erreurs, d'anomalies et de coins tournés un peu ronds était ressorti des trois journées d'audiences du comité chargé d'enquêter sur le programme de thérapie génique de l'Université de Pennsylvanie.

Cette décision de la Food and Drug Administration (FDA) n'en est pas moins inhabituelle :

c'est l'ensemble d'un programme -huit expériences, dont cinq sur des patients, actuellement en cours- qui est mis sous scellés et ce, pour une période indéterminée. La suspension ne sera levée, explique la FDA dans une lettre laconique de deux pages, que lorsque l'Institut de thérapie génique de l'Université de Pennsylvanie aura apporté des preuves convaincantes qu'il a modifié ses pratiques.

Comme son nom l'indique,.la thérapie génique s'attaque aux gènes, plus précisément aux gènes défectueux, qu'elle essaie d'éliminer/de stimuler ou de ralentir, suivant la maladie. Le traitement demeure, même après neuf années, encore hautement expérimental, et son efficacité reste à démontrer.

Jesse Gelsinger, 18 ans, atteint d'une maladie héréditaire du foie, est décédé le 17 septembre d'une réaction brutale de son système immunitaire à un de ces traitements. Il est la première personne à mourir d'une thérapie génique -ce qui n'a pas empêché les parents des autres patients de démontrer une foi sans failles lors des audiences du comité. Y compris le père de Jesse Gelsinger.

Ces audiences avaient parfois viré en histoire d'horreur : Jesse Gelsinger avait été souffrant au cours des jours précédents, ce qui l'aurait théoriquement rendu inapte à subir le traitement, ce qui n'a pas empêché celui-ci de se poursuivre; d'autres patients ayant subi de graves effets secondaires au cours des mois précédents n'avaient pas été signalé à la FDA, comme c'est la règle pour tout traitements expérimentales décès de singes des suites d'une thérapie génique n'avaient pas fait l'objet d'études poussées; et ainsi de suite...

Nathalie Tafer Gr. 406

La Phénylcétonurie

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