Depuis quelques annÈes, les progrËs de la recherche permettent de doter une espËce de caractÈristiques qu'elle ne possËde pas naturellement. Cette Èvolution a donnÈ lieu ý de nombreux travaux, motivÈs par l'Ènorme pouvoir que confËre ý l'homme la transgÈnËse : la capacitÈ maÓtrisÈe de crÈer de la diversitÈ gÈnÈtique, c'est-ý-dire, la possibilitÈ de transfÈrer un gËne d'un organisme ý un autre, en s'affranchissant de la barriËre de genre et d'espËce. Cet organisme, affectÈ de ce nouveau gËne, est ainsi appelÈ Organisme GÈnÈtiquement ModifiÈ (OGM).

Par exemple, les melons mšrissent ainsi moins vite, les fraises ne pourrissent plus, les tomates se conservent mieux… Tous ces produits n'ont pas encore fait leur apparition sur les Ètals franÁais mais existent dÈjý aux Etats-Unis.

Mais d'une maniËre technique, comment obtient-on OGM ?

Comment obtient-on un OGM ?

Les techniques de transformation

La premiËre phase du transfert consiste ý isoler le gËne d'intÈrÍt par le biais de la sÈlection. Ce gËne sera alors extrait, puis purifiÈ avant d'Ítre intÈgrÈ dans une construction molÈculaire qui est constituÈe de trois ÈlÈments :

  • un promoteur, c'est ý dire une sÈquence placÈe en amont du gËne et qui est nÈcessaire ý sa transcription,
  • un gËne d'intÈrÍt, qui comprend Ègalement un marqueur visuel et marqueur de sÈlection,
  • un site de terminaison, sÈquence prÈsente en aval et au niveau de laquelle l'Èlongation de l'ARN (Acide RiboNuclÈique) prend fin.

Comme les techniques d'introduction de ces constructions dans le gÈnome demandent une grande quantitÈ d'ADN (Acide DÈsoxyriboNuclÈique), il sera nÈcessaire de multiplier la construction. Cette opÈration est rÈalisÈe en introduisant celle-ci dans un plasmide dotÈ d'une sÈquence qui lui permettra de se rÈpliquer de faÁon autonome dans une bactÈrie-hÙte.

La modification gÈnÈtique d'un organisme se fait par deux approches :

1. Le transfert direct

La transformation directe consiste en l'introduction dans le gÈnome d'un gËne vÈhiculÈ le plus souvent par un plasmide classique (exemple : pUC), par le biais de techniques physico-chimiques.

La premiËre mÈthode de transfert direct fut l'introduction mÈcanique d'ADN dans des protoplastes (cellules dont on a ÙtÈ la paroi pectocellulosique). La cellule peut alors Ítre facilement transformÈe par des techniques chimiques ou physiques :

  • le polyÈthylËneglycol (PEG), qui est un agent chimique possÈdant la facultÈ de dÈstabiliser la membrane plasmique des protoplastes, permettant ainsi la pÈnÈtration des molÈcules d'ADN,
  • l'Èlectroporation, plus dÈlicate ý maÓtriser, consiste ý appliquer de courts chocs Èlectriques de fort voltage aux protoplastes, ce qui permet l'ouverture de pores facilitant le passage de l'ADN. Le principal problËme de ces deux mÈthodes est la faible capacitÈ de rÈgÈnÈration des protoplastes ainsi que le risque de voir apparaÓtre un transfert de plusieurs copies, ce qui aura des rÈpercussions sur la stabilitÈ de l'insert ou de son expression.
  • La microinjection est une autre mÈthode de transfert physique, basÈe sur l'utilisation de microseringues manipulÈes sous microscope et permettant l'introduction directe de molÈcules, voire d'organites entiers, dans des cellules isolÈes. Cependant, cette mÈthode ne s'applique que dans des cas particuliers car elle est complexe et lourde ý utiliser.
  • Parmi toutes ces techniques, la plus courante est l'utilisation du " canon ý gËnes ", Ègalement appelÈe biolistique. Cette mÈthode consiste ý propulser le transgËne ý l'intÈrieur de cellules vÈgÈtales, isolÈes ou appartenant ý un tissu ou ý un organe. Les constructions molÈculaires sont adsorbÈes ý la surface de projectiles microscopiques (billes d'or de 0,6 ý 2 µm de diamËtre), qui seront bombardÈs sur les cellules vÈgÈtales. Ces billes seront progressivement freinÈes en traversant les diffÈrentes couches cellulaires. Quelques unes des cellules atteintes vont alors insÈrer spontanÈment les transgËnes dans leur gÈnome. La biolistique a ainsi ÈtÈ employÈe sur de nombreuses espËces vÈgÈtales : blÈ, maÔs, riz, soja, tabac...

2. Le transfert indirect

Le dÈveloppement de la transgÈnËse vÈgÈtale a connu son essor gr’ce ý la dÈcouverte de bactÈries telluriques phytopathogËnes : Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes.

Ces micro-organismes sont capables de dÈtourner ý leur profit le mÈtabolisme de certaines espËces vÈgÈtales en faisant produire, aux cellules qu'ils infectent, des molÈcules nutritives (appelÈes opines) nÈcessaires ý leur croissance. Il a ÈtÈ ainsi dÈmontrÈ que ce dÈrËglement cellulaire Ètait dš ý une vÈritable opÈration de gÈnie gÈnÈtique, dont les responsables sont des plasmides d'environ 200 kb : Ti et Ri.

En fait, suite ý l'infection bactÈrienne, c'est l'intÈgration dans le gÈnome de la plante d'un fragment de ces plasmides, le T-DNA, qui conduit au dÈrËglement mÈtabolique. Les chercheurs ce sont donc servi de ces T-DNA pour pouvoir intÈgrer les gËnes d'intÈrÍt aux gÈnomes des plantes (cf. annexe 1 - Transformation d'une cellule vÈgÈtale).

Le principal avantage de la transformation par Agrobacterium est sa simplicitÈ d'utilisation. Par ailleurs, dans 50% des cas, le transgËne est intÈgrÈ sous la forme d'une seule copie et sans contamination par des sÈquences plasmidiques externes au T-DNA.

Cependant il existe quelques inconvÈnients :

  • grande spÈcificitÈ d'hÙte des cellules souches d'Agrobacterium, ce qui limite son application aux espËces sensibles ý son action,
  • persistance potentielle, pendant quelques mois, de la bactÈrie dans la plante, ce qui peut poser un problËme pour le suivi de la plante,
  • limitation de la quantitÈ d'ADN transfÈrable.

Suivi de l'expression du gËne

1. SÈlection des cellules transformÈes

L'application des techniques de transgÈnËse ý un explant vÈgÈtal permet l'intÈgration du gËne dans seulement un trËs petit nombre de ses cellules. Il faut donc sÈlectionner puis multiplier les cellules transformÈes, avant de rÈgÈnÈrer la plante entiËre.

L'opÈration de sÈlection fait appel ý deux catÈgories de gËnes :

  • les gËnes marqueurs confÈrant ý la cellule transgÈnique une rÈsistance ý des substances chimiques toxiques (herbicides ou antibiotiques comme l'ampicilline ou la kanamycine). La sÈlection consistera ý cultiver les cellules transformÈes sur un milieu contenant cette substance.
  • les gËnes rapporteurs (ou marqueurs visuels, par exemple le gËne GUS) codant pour des produits qui, dans certaines conditions, donnent une couleur caractÈristique aux tissus transgÈniques.

2. RÈgÈnÈration des plantes

La rÈgÈnÈration est la phase durant laquelle les cellules, les tissus, ou les organes transgÈniques sÈlectionnÈs sont placÈs dans des conditions qui leur permettront de gÈnÈrer une plante entiËre. Ceci ne sera rendu possible que par les techniques de culture in vitro.

3. Suivi du gËne dans la plante

Pendant tout son dÈveloppement, la plante nÈoformÈe sera ÈtudiÈe gr’ce ý des mÈthodes de biologie molÈculaire (Southern ou Western-blot, PCR) afin de vÈrifier l'intÈgration des transgËnes et d'analyser leur expression.

Le temps ÈcoulÈ entre l'introduction du transgËne dans les premiËres cellules vÈgÈtales et l'obtention de la descendance varie entre 6 et 9 mois et dÈpend des techniques de culture in vitro et de la physiologie de chaque espËce. Selon le type de promoteur employÈ, on disposera des premiËres informations sur l'expression du transgËne dËs la rÈgÈnÈration des premiers tissus, ou bien, seulement ý l'obtention des semences.
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Tous droits rÈservÈs Carole CANTET, Catherine CHOSSAT, Boris COIMET, Laure ROBERT et Vincent TANDART, 1999
DerniËre mise ý jour le 06 mars 1999 19:36:54

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